2023年6月7-8日，瑞沃德特邀達(dá)普生物產(chǎn)品經(jīng)理潘鑫和達(dá)普生物、高級科學(xué)家肖之夏做客直播間，以“單細(xì)胞測序:從樣本制備到數(shù)據(jù)挖掘的全流程探討”為主題進(jìn)行精彩分享，在線與大家一起探討單細(xì)胞測序的奧秘！

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6月7日，達(dá)普生物產(chǎn)品經(jīng)理潘鑫老師，圍繞“從測序演變探討單細(xì)胞測序樣本制備與建庫解決方案”主題進(jìn)行分享，從測序發(fā)展概述、單細(xì)胞測序到樣本制備及建庫重點(diǎn)難點(diǎn)解決進(jìn)行全面講解。

其中，潘鑫老師為大家分享“達(dá)普生物Galaxy系統(tǒng)與瑞沃德單細(xì)胞懸液制備儀無縫連接”案例，再次強(qiáng)調(diào)瑞沃德與達(dá)普生物雙方強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，攜手推進(jìn)單細(xì)胞測序領(lǐng)域發(fā)展的決心。

6月8日，達(dá)普生物、高級科學(xué)家肖之夏老師為大家分享“單細(xì)胞測序生信分析及數(shù)據(jù)挖掘”的主題內(nèi)容，詳解生信分析概要、生信報告解讀、生信數(shù)據(jù)挖掘及案例展示以及如何搭建一個好的生信平臺。

其中，肖之夏老師在線仔細(xì)解讀“Scaling of scRNA-seq experiments”“scRNA-seq Workflow & Application”“Reads Quality & Mapping Statistics”等等單細(xì)胞技術(shù)的核心要點(diǎn)及步驟。

答疑精選，問題詳解

在直播答疑互動環(huán)節(jié)，兩場直播在微信視頻號、嗶哩嗶哩等平臺收到很多在線觀眾提問，現(xiàn)將兩場直播聊天區(qū)的問題，精選26個來詳細(xì)解答。

聊天區(qū)部分問題詳解

6月7日樣本制備

1. 請問老師微流控芯片最多可以同時處理多少個樣本呢？

答：達(dá)普的Galaxy單細(xì)胞建庫系統(tǒng)，每張芯片有可以同時處理4個樣本的，也有可以同時處理8個樣本的，且芯片上的每個樣本都是獨(dú)立運(yùn)行，單次可處理1個樣本，不影響芯片下次使用。

2. 請問單細(xì)胞測序?qū)颖居心男┮笱剑?/p>

答：單細(xì)胞測序要求盡量采用新鮮的組織樣本或血液樣本進(jìn)行單細(xì)胞懸液制備，單細(xì)胞懸液制備后要求細(xì)胞活性大于85%， 團(tuán)塊率小于5%，細(xì)胞濃度500-1200cell/μL，非細(xì)胞雜質(zhì)占比小于30%。

3. 雙胞率多少？如果會的話后續(xù)結(jié)果有影響嗎？

答：通過人鼠混合細(xì)胞進(jìn)行雙包率測序，結(jié)果顯示Galaxy 平臺的雙包率為1.1%/3000個，后期數(shù)據(jù)分析的時候可以過濾掉。

4. 利用消化酶解離細(xì)胞的時候，會不會影響細(xì)胞的表面抗原影響后續(xù)流式分選？

答：在保證細(xì)胞活性能滿足建庫要求的前提下，對細(xì)胞表面抗原影響較小，酶解是比較經(jīng)典的組織解離方式，一般流式分選前的細(xì)胞懸液制備也都是通過這種方式實(shí)現(xiàn)，絕大部分樣本效果還是比較好。

5. 神經(jīng)元樣本怎么做單細(xì)胞測序？

答：條件允許情況下，應(yīng)將組織樣品充分灌注后進(jìn)行解離。神經(jīng)元樣品制備細(xì)胞核懸液操作相對簡單，且雜質(zhì)較少，顆粒參數(shù)更適合單細(xì)胞平臺上機(jī)。如果能夠制備出滿足平臺上機(jī)要求的單細(xì)胞懸液，也可以使用單細(xì)胞懸液上機(jī)，可嘗試使用瑞沃德腦組織解離試劑盒。

具體的操作方法我們也有各地域?qū)I(yè)的技術(shù)支持同事根據(jù)不同樣本類型來提供給您一些處理意見。

6. 老師這里講的都是腫瘤相關(guān)的，發(fā)育相關(guān)的研究單細(xì)胞測序怎么做??？

答：根據(jù)研究需求，取不同發(fā)育階段組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序， 之后構(gòu)建細(xì)胞圖譜，鑒定細(xì)胞類群，找到跟發(fā)育相關(guān)的生物標(biāo)志物，通過擬時性分析細(xì)胞的發(fā)育軌跡等，分析基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等，以揭示細(xì)胞發(fā)育的深層機(jī)制等。

7. 你好，間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行測序的話怎么處理樣本呢？

答：如果您只想做單純的間充質(zhì)干細(xì)胞測序的話，在制備組織單細(xì)胞懸液后，先需要通過流式或磁珠分選的方式富集間充質(zhì)干細(xì)胞，之后再按常規(guī)樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序文庫構(gòu)建，測序及數(shù)據(jù)分析即可。

8. 帶熒光細(xì)胞分選要注意什么？

答：細(xì)胞熒光對單細(xì)胞測序的捕獲和建庫過程沒有影響，可正常進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

9. 外周血樣本如何儲存？

答：準(zhǔn)備進(jìn)行單細(xì)胞測序的外周血樣本，需要先分離PBMC之后再收集PBMC加入凍存液進(jìn)行梯度凍存。

10. 請問，手術(shù)組織標(biāo)本，放RNA-later，凍-80，可以用來單細(xì)胞測序嗎？

答：凍存和固定后的細(xì)胞不建議進(jìn)行單細(xì)胞測序，加了RNA-later，組織細(xì)胞活性會受損，這個試劑主要是固定RNA，方便后面RNA提取，而單細(xì)胞測序?qū)?xì)胞活性有比較高的要求，一般來說如果條件允許，盡量別凍存后復(fù)蘇做單細(xì)胞，之前做過老師凍存的樣本，發(fā)現(xiàn)中位基因數(shù)會低，以及細(xì)胞類群相比于新鮮的會有所改變。

11. 請問可不可以做細(xì)胞核單細(xì)胞測序呢？

答：細(xì)胞核的樣本的單細(xì)胞測序也是可以兼容的，我們之前嘗試過人鼠細(xì)胞系混合樣本提核，效果還不錯。

12. 老師您好，不同測序平臺有什么區(qū)別嗎？我們該如何選擇？

答：對于Galaxy 單細(xì)胞建庫系統(tǒng)構(gòu)建的文庫，在不同測序平臺上的主要區(qū)別是價格不一樣， 所以怎樣選擇主要是看您對測序價格的考慮；Galaxy構(gòu)建的文庫在不同測序獲得數(shù)據(jù)是高度一致的。

而對于一些其他平臺構(gòu)建的單細(xì)胞測序文庫在不同平臺上測序除了價格上的差異，另外就不同測序平臺測出的基因中位數(shù)可能會有20%左右的差異， 這時選擇就需要綜合數(shù)據(jù)質(zhì)量和價格雙因素綜合考慮了。

13. 請問老師有推薦的實(shí)驗(yàn)工具或者軟件嗎？ 

答：單細(xì)胞測序的整個流程包括包括樣本解離，細(xì)胞懸液質(zhì)檢，文庫構(gòu)建與質(zhì)檢，測序及數(shù)據(jù)分析，在組織樣本解離與懸液質(zhì)檢這部分，可以通過手動酶解方式，也可以通過酶解+自動解離方式，瑞沃德有配套單細(xì)胞懸液酶解試劑盒、全自動單細(xì)胞懸液制備儀、細(xì)胞計數(shù)儀供大家完成單細(xì)胞懸液及細(xì)胞質(zhì)檢部分的工作，在單細(xì)胞建庫這部分，達(dá)普生物有Galaxy 單細(xì)胞建庫系統(tǒng)及配套的3’轉(zhuǎn)錄組試劑供大家適用，并且有配套的生信分析軟件StarScope幫助大家完成從原始數(shù)據(jù)到生信報告的分析，導(dǎo)出的表達(dá)矩陣可兼容第三方軟件下游的分析軟件我們推薦使用， 測序可以兼容主流的測序平臺如Novaseq vs T7等。

6月8日 生信分析問題解答

1. 老師您好，有好用的工具或軟件推薦嗎？

答：對于生信數(shù)據(jù)部分，原始數(shù)據(jù)分析可以使用達(dá)普自主研發(fā)的StarScope軟件進(jìn)行分析，獲得表達(dá)矩陣后，可以兼容第三方的軟件，下游的分析軟件我們推薦使用：

seurat（網(wǎng)址：https://satijalab.org/seurat/articles/install.html）

scanpy（網(wǎng)址：https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/）

scater（網(wǎng)址：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/scater.html）

如以人PBMCs為例，細(xì)胞鑒定可以借助CellMarker2.0軟件 ；數(shù)據(jù)的整合分析可借助Seurat5 工具；

2. 請問老師有哪些單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫是比較好用的呢？

答：目前比較好用的數(shù)據(jù)庫有：Panglaodb，Human Protein Atlas等。

3. 如何判斷數(shù)據(jù)的質(zhì)量是否ok？有固定的某幾個數(shù)據(jù)綜合來看嗎？或者數(shù)據(jù)的值高于某個固定數(shù)值，就能表明數(shù)據(jù)的質(zhì)量是比較好的？

答：判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量最直觀首先看測序的Q30是否大于90%， 其次看捕獲的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞捕獲大于45%以上是比較正常，再就基因中位數(shù)，正常基因中位大于1000比較正常，reads Mapping到基因組上的信息是否大于90%，再深入一點(diǎn)就看線粒體基因污染，被檢測到的線粒體基因百分?jǐn)?shù)，一般細(xì)胞有>20%線粒體基因表達(dá)的話，被認(rèn)為是死細(xì)胞。

Cell barcode圖的拐點(diǎn)是否明顯，不明顯可能就是細(xì)胞碎片比較多。

4. 請問細(xì)胞通訊分析的計算方法中，一般是分析系統(tǒng)中根據(jù)不同細(xì)胞默認(rèn)的一個數(shù)值？還是需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)多次嘗試？

答：Cell-cell communication的分析中較為常用的軟件是cellphoneDB。其input包括normalized過的表達(dá)矩陣，每個細(xì)胞的細(xì)胞類型信息（需要預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞類型注釋），和cellphoneDB的數(shù)據(jù)庫文件。一般使用默認(rèn)的參數(shù)就可以適用于大多數(shù)的研究了。

5. 分群的時候T細(xì)胞的兩個cluster分的很遠(yuǎn)，沒在一起怎么辦？

答：如果是多樣本整合的結(jié)果可以先確認(rèn)下是否是批次效應(yīng)等原因?qū)е碌摹 細(xì)胞本身包括兩大類群CD4和CD8，在正常數(shù)據(jù)中就會存在兩個不同的分群。

另外在病人或者是接受了處理的數(shù)據(jù)中，很可能還會已經(jīng)有了免疫細(xì)胞的響應(yīng)，在多樣本整合的結(jié)果中還有可能出現(xiàn)多個不同響應(yīng)的細(xì)胞群體，所以是有可能出現(xiàn)不同存在于不同的cluster的。另外UMAP和TSNE中的距離是經(jīng)過特定的換算，并不能代表實(shí)際的細(xì)胞距離。

6. 老師好，單細(xì)胞過濾的時候，有關(guān)紅細(xì)胞基因是否要過濾？

答：一般單細(xì)胞懸液制備的過程中，都會加一個破紅的過程以去除紅細(xì)胞，正常情況都不做紅細(xì)胞過濾處理。

7. 老師好，想請問下，要拿到像您show的那么漂亮的數(shù)據(jù)，對細(xì)胞的要求是怎樣的呀？

答：對細(xì)胞的要求是，首先無論組織樣本還是血液樣本，盡量采用新鮮樣本， 細(xì)胞懸液活性85%以上，團(tuán)塊率小于5%， 細(xì)胞濃度不低于500-1200cell/μL。

8. 想問一下老師，影響測序深度的因素有哪些呀？

答：影響測序深度主要是組織類型和狀態(tài)，細(xì)胞捕獲數(shù)和測序的數(shù)據(jù)量，測序數(shù)據(jù)量越高，測序質(zhì)量好，測序深度就越高。

9. 孔板法和微流控各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？應(yīng)該怎么選擇呢？

答：孔板法的有點(diǎn)是對細(xì)胞活性要求相對低一些，缺點(diǎn)是單次運(yùn)行樣本數(shù)量少，一般1-2個樣本，且每張芯片上微孔數(shù)有限，細(xì)胞上樣量相對較低，獲得細(xì)胞較少；

微流控的優(yōu)點(diǎn)是單次可同時處理多個樣本，且每個樣本可上數(shù)萬個細(xì)胞，細(xì)胞捕獲率也比較高，50%以上，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求及樣本情況進(jìn)行選擇，希望獲得更多細(xì)胞樣本的信息可以選擇微流控平臺；對于樣本量少，細(xì)胞活性也不好的樣本，可以試試微孔板法，應(yīng)該也能獲得一部分細(xì)胞的信息。   

10. 請問老師測序的數(shù)據(jù)量和捕獲細(xì)胞數(shù)對數(shù)據(jù)的結(jié)果影響大嗎？

答：不同的測序深度，在達(dá)到飽和之前，獲得基因中位數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量相差比較大，基因中位數(shù)不同的組織樣本的標(biāo)準(zhǔn)差別較大，一般應(yīng)該大于1000；捕獲的細(xì)胞數(shù)量對不同研究需求有一定的影響，如一些稀有細(xì)胞群的鑒定可能會受影響。

11. 請問老師影響捕獲細(xì)胞數(shù)量的因素有哪些呀？

答：影響細(xì)胞捕獲的因素包括：細(xì)胞懸液的質(zhì)量（活性，細(xì)胞碎片、團(tuán)塊率），投入的細(xì)胞數(shù)量及單細(xì)胞包裹是否成功，反轉(zhuǎn)錄建庫試劑盒性能等都會影捕獲的細(xì)胞數(shù)量。

12. 3'和5'的基因表達(dá)文庫有什么不同嗎？

答：3'和5'的基因表達(dá)文庫的不同一個是獲得3'端基因序列，一個是獲得5'端基因序列，5'端主要用于免疫組庫的分析

13. 請問能專門做粒細(xì)胞的單細(xì)胞測序嗎？

答：由于粒細(xì)胞離體后仍然非常活躍，容易在獲取過程或?qū)嶒?yàn)過程中破碎、死亡，有些研究表明其會向背景中釋放可剪切游離核酸片段的物質(zhì)，影響測序質(zhì)量，以上因素導(dǎo)致含粒細(xì)胞比例較大的樣本很難得到有效的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，一些多組學(xué)實(shí)驗(yàn)中則需要設(shè)法去除中性粒細(xì)胞。

截至目前，針對粒細(xì)胞的高通量單細(xì)胞測序尚無高質(zhì)量的數(shù)據(jù)結(jié)果。

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